分子發(fā)光包括熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光和散射光譜等。基于化合物的熒光測(cè)量而建立起來(lái)的分析方法稱(chēng)為分子熒光光譜法。
由光源發(fā)出的光通過(guò)切光器使其變成斷續(xù)之光，通過(guò)激發(fā)光單色器變成單色光，此光即為熒光物質(zhì)的激發(fā)光。被測(cè)的熒光物質(zhì)在激發(fā)光照射下所發(fā)出的熒光，經(jīng)過(guò)單色器變成單色熒光后照射于光電倍增管上，由其所發(fā)生的光電流經(jīng)過(guò)放大器放大輸至記錄儀。一個(gè)激發(fā)，一個(gè)發(fā)射，采用雙單色器系統(tǒng)，可分別測(cè)量激發(fā)光譜和熒光光譜。
熒光光譜儀主要包括光源、激發(fā)單色器、樣品池、熒光單色器及檢測(cè)器等主要部件。
1.光源
早期的熒光分光光度計(jì)，配有能發(fā)生很窄汞線(xiàn)的低壓汞燈。使用高壓汞燈，譜線(xiàn)被加寬，而且也存在高強(qiáng)度的連續(xù)帶。然而，一個(gè)完整的激發(fā)光譜的測(cè)定需一種能發(fā)射從可見(jiàn)到紫外范圍的較高強(qiáng)度的光輻射的燈。氙弧燈能適于此條件，因此，它是目前在熒光分光光度計(jì)中*泛使用的光源。
2.單色器
單色器的作用是把光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解成單色光，并能準(zhǔn)確方便地“取出”所需要的某一波長(zhǎng)的光，它是光譜儀的心臟部分。單色器主要由狹縫、色散元件和透鏡系統(tǒng)組成，其中色散元件是關(guān)鍵部件。色散元件是棱鏡和反射光柵或兩者的組合，它能將連續(xù)光譜色散成為單色光。
(1)棱鏡單色器
棱鏡單色器是利用不同波長(zhǎng)的光在棱鏡內(nèi)折射率不同將復(fù)合光色散為單色光的。棱鏡色散作用的大小與棱鏡制作材料及幾何形狀有關(guān)。常用的棱鏡用玻璃或石英制成?？梢?jiàn)分光光度計(jì)可以采用玻，它適用于紫外、可見(jiàn)整個(gè)光譜區(qū)。
(2)光柵單色器
光柵作為色散元件具有不少*的優(yōu)點(diǎn)。光柵可定義為一系列等寬、等距離的平行狹縫。光柵的色散原理是以光的衍射現(xiàn)象和干涉現(xiàn)象為基礎(chǔ)的。常用的光柵單色器為反射光柵單色器，它又分為平面反射光柵和凹面反射光柵兩種，其中常用的是平面反射光柵。光柵單色器的分辨率比棱鏡單色器分辨率高(可達(dá)±0.2nm)，而且它可用的波長(zhǎng)范圍也比棱鏡單色器寬，且入射光80%的能量在一級(jí)光譜中。近年來(lái)，光柵的刻制復(fù)制技術(shù)也在不斷地改進(jìn)，其質(zhì)量也在不斷的提高，因而其應(yīng)用日益廣泛。
(3)狹縫
狹縫是單色器的重要組成部分，直接影響到分辨率。狹縫寬度越小，單色性越好，但光強(qiáng)度也隨之減少。
3.樣品池
熒光儀用的樣品池需用低熒光的材料制成，通常用玻璃和石英材料，形狀以方形和長(zhǎng)方形為宜。
4.檢測(cè)器
主要有硒光電池、光電管和光電倍增管等。目前來(lái)說(shuō)由于熒光的強(qiáng)度較弱，一般以光電倍增管作檢測(cè)器。選擇光電倍增管要考慮響應(yīng)波長(zhǎng)、靈敏度和噪聲水平等。藍(lán)敏管對(duì)蛋白質(zhì)、核酸的測(cè)量適用，而紅敏管則適用于熒光染料檢測(cè)。
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